一篇看懂液相色譜柱的分類(lèi)、選擇及維護(hù)!
 

　　1.硅膠基質(zhì)
 

　　1.1反相色譜柱：反相色譜填料常是以硅膠為基礎(chǔ)，表面鍵合有極性相對(duì)較弱的官能團(tuán)的鍵合相。反相色譜所使用的流動(dòng)相極性較強(qiáng)，通常為水，緩沖液與甲醇，已腈等混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強(qiáng)組合最先被沖出，而極性弱的組份會(huì)在色譜柱上有更強(qiáng)的保留。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。
 

　　1.2正相色譜：正相色譜用的固定相通常為硅膠(Silica)，以及其他具有極性官能團(tuán)，如胺基團(tuán)(NH2,APS)和氰基團(tuán)(CN，CPS)的鍵合相填料。由于硅膠表面的硅羥基(SiOH)或其他團(tuán)的極性較強(qiáng)，因此，分離的次序是依據(jù)樣品中的各組份的極性大小，即極性強(qiáng)弱的組份最先被沖洗出色譜柱。正相色譜使用的流動(dòng)相極性相對(duì)比固定相低，如：正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(MethyleneChloride)等。
 

　　1.3離子交換色譜柱：以磺化交聯(lián)強(qiáng)陰/陽(yáng)離子鍵合硅膠色譜柱，常用規(guī)格：強(qiáng)陰離子色譜柱(SAX)，強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜柱(SCX)
 

　　2.聚合物基質(zhì):聚合物調(diào)料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等，其主要優(yōu)點(diǎn)是在PH值為1～14均可使用。相對(duì)與硅膠基質(zhì)的C18填料，這類(lèi)填料具有更強(qiáng)的疏水性；大孔的聚合物填料對(duì)蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效?，F(xiàn)在的聚合物填料的缺點(diǎn)是相對(duì)硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低。
 

　　所有聚合物基質(zhì)在流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)都會(huì)出現(xiàn)膨脹或收縮。用于HPLC的高交聯(lián)度聚合物填料，其膨脹和收縮要有限制。溶劑或小分子容易滲入聚合物基質(zhì)中，因?yàn)樾》肿釉诰酆衔锘|(zhì)中的傳質(zhì)比在陶瓷性基質(zhì)中慢，所以造成小分子在這種基質(zhì)中柱效低。對(duì)于大分子像蛋白質(zhì)或合成的高聚物，聚合物基質(zhì)的效能比得上陶瓷性基質(zhì)。因此，聚合物基質(zhì)廣泛用于分離大分子物質(zhì)。
 

　　3.其他無(wú)機(jī)填料:其它HPLC的無(wú)機(jī)填料色譜柱也已經(jīng)商品化。
 

　　由于其特殊的性質(zhì)，一般僅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐漸成為反相色譜填料。這種填料的分離不同與硅膠基質(zhì)烷基鍵合相，石墨化碳的表面即是保留的基礎(chǔ)，不再需其它的表面改性，該柱填料一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物填料的保留能力更強(qiáng)，石墨化碳可用于分離某些幾何導(dǎo)構(gòu)體，又由于HPLC流動(dòng)相中不會(huì)被溶解，這類(lèi)柱可在任何PH與溫度下使用。
 

　　氧化鋁也可用于HPLC，氧化鋁微粒剛性強(qiáng)，可制成穩(wěn)定的色譜柱柱床，其優(yōu)點(diǎn)是可在PH高達(dá)12的流動(dòng)相中使用。
 

　　但由于氧化鋁與堿性化合物作用也很強(qiáng)，應(yīng)用范圍受到一定的限制，所以未能廣泛應(yīng)用，新型氧化鋯填料也可用于HPLC，商品化的僅有聚合物涂層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應(yīng)用PH范圍1～14，溫度可達(dá)100℃。由于氧化鋯填料幾年才開(kāi)始研究，加之面臨的實(shí)驗(yàn)難度，其重要用途與優(yōu)勢(shì)尚在進(jìn)行中。
 

　　二.色譜柱的選擇
 

　　液相色譜儀基質(zhì)的選擇大致遵循以下法則，硅膠基質(zhì)的填料被用于大部分的HPLC分析，尤其是小分子量的被分析物，聚合物填料用于大分子量的被分析物質(zhì)，主要用來(lái)制成分子排阻和離子交換柱。
 

　　色譜柱在使用前，最好進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測(cè)試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。
 

　　三.色譜柱的維護(hù)
 

　　1.色譜柱的平衡
 

　　反相色譜柱由工廠測(cè)試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請(qǐng)一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來(lái)平衡色譜柱，您就會(huì)在處理問(wèn)題方面獲得最大的"補(bǔ)償"，
 

　　2.色譜柱的再生,長(zhǎng)期使用的色譜柱，往往柱效會(huì)下降(柱子的理論塔板數(shù)減低)?？梢詫?duì)色譜柱進(jìn)行再生，在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。
 

　　建議用來(lái)沖洗柱子的溶劑體積
 

　　3.色譜柱的維護(hù)
 

　　a.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度)
 

　　b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍
 

　　c.避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化
 

　　d.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理
 

　　e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中
 

　　f.氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑，以避免腐蝕。